引言
在全球范围内，器官移植作为对抗严重器官衰竭的关键医疗手段，其需求持续攀升。根据世界卫生组织的全球捐献与移植观察站（GODT）的数据，尽管移植活动有所增加，但与迫切的需求相比仍显不足。2021年全球共进行了约144,302例实体器官移植，但这仅满足了全球需求的不到10%。[1][2]
[1]P. Farinelli, J. Juri, D. Varela, M. Salome, L. Bisigniano, C. Raimondi, et al.
Donation after Cardiocirculatory Death: a program that we must implement Experts Argentinean meeting report, 8 (2) (2023), Article 100132, 10.1016/j.tpr.2023.100132
[2] Samin，Y.，等人。 （2023）。巴基斯坦白沙瓦三级护理医院患者加入国家器官捐赠登记处的障碍和推动因素。库鲁乌斯。doi.org/10.7759/cureus.37997
3D生物打印组织工程
全球器官移植现状
2021年的数据显示，肾移植、肝移植、心脏移植、肺移植、胰腺移植和小肠移植的数量分别为92,532例、34,694例、8,409例、6,470例、2,025例和172例，这些数字虽然较前一年增长了11.3%，但与需要器官移植的人数相比，缺口依然巨大。仅在美国，去年就进行了约47,000 例器官移植手术，较 2022 年大幅增长约 8% 。此外，大约38%的肾脏移植和23%的肝脏移植依赖于活体捐献者，显示了在提高器官供应方面的紧迫需求[1][3]。
[3] 器官获取与移植网。 （2024）。器官捐献持续增加，2023年再创新高；突破了新的里程碑。 [在线]器官获取移植网https ://optn.transplant.hrsa.gov/news/continued-increase-in-organ-donation-drives-new-records-in-2023-new-milestones-exceeded/
面对挑战，3D生物打印技术应运而生，为缓解器官短缺问题提供了一种前所未有的解决方案，目的是构建具有生理功能的组织和器官，用于修复人体的疾病和缺损。3D生物打印技术作为一种前沿的组织工程技术，虽然展现出巨大的潜力和前景，但在实际应用过程中仍面临许多技术限制：生物墨水的制备与选择、细胞存活率与功能维护、多材料打印技术的整合、打印精度与分辨率等。
其中打印精度和分辨率更是直接影响到生成组织结构的功能性，尤其是在需要高度精细结构的应用中，如血管网络或复杂器官等，体外构建的组织就是因为缺乏与之相适应的血液供应系统，所以只有皮肤、软骨和骨组织工程产品应用于临床。现阶段科学家已经成功打印出人工心脏、肝脏、肺、肾等组织器官，但人工微血管网络尤其是毛细血管网络（管径为 6~9μm）打印始终是组织工程中一个难题和瓶颈。
为解决这一技术难题，研究人员们利用飞秒激光的低热效应，结合3D打印技术，以其精确控制和细节处理能力，成为构建复杂生物组织的有力工具。利用飞秒激光3D打印技术，科学家们已能构建具有复杂毛细血管网络的生物组织，这些网络对于器官功能至关重要。通过这种高精度的打印技术，未来的器官移植有望实现完全自给自足，极大地减少等待时间并降低相关死亡率。
在接下来的部分中，我们将详细探讨飞秒激光3D打印技术的工作原理、成功案例及其在全球医疗领域中的应用前景。
飞秒激光3D生物打印的优势
在现代生物医学研究和应用中，激光辅助生物打印技术是一项革命性的技术，广泛应用于组织工程、器官打印和再生医学等领域。
它在移植的生物医学创新中起着关键作用，因其极低的污染风险而受到青睐。在基于激光的生物3D打印过程中，细胞经历的机械应力要小得多，从而显著提高细胞活力
用于生成3d打印器官的基于激光的生物打印适用于需要过度改变的各种生物材料。与基于液滴的生物打印等其他方法相比，激光辅助的生物3D打印具有更高的打印速度，从而具有更高的分辨率和准确性。在细胞沉积方面，LAB能够精确控制每个液滴的细胞数量，并促进高细胞密度。[4]
飞秒激光3D打印技术的工作原理/技术路线
飞秒激光器发出极其短暂的光脉冲，每个脉冲仅持续几百飞秒。这种超短的能量爆发可以以极高的精度和最小的热传递来切割或修改材料，这在处理人体组织等敏感材料时至关重要。与传统激光器加热并可能损坏其所改变的材料不同，飞秒激光器提供“冷”加工过程。此功能对于医疗应用至关重要，因为热量造成的任何额外损坏都会损害正在打印的组织或细胞的完整性。
基于飞秒激光的3D打印技术在组织工程和细胞生物学中的应用
[5]Ho, Chee Meng Benjamin; Mishra, Abhinay; Hu, Kan; An, Jianing; Kim, Young-Jin; Yoon, Yong-Jin (2017). Review: Femtosecond-laser-based 3D Printing for Tissue Engineering and Cell Biology Applications. ACS Biomaterials Science & Engineering, (), acsbiomaterials.7b00438–. doi:10.1021/acsbiomaterials.7b00438
飞秒激光3D打印在组织工程和细胞生物学中的应用，主要基于以上特性使其能够有精确制造微观和亚微观结构的能力。这种打印技术利用可见光和近红外（NIR）飞秒激光脉冲，通过计算机辅助设计（CAD）生成3D组织支架，有效模仿组织的微环境。主要应用原理包括：
1.多光子聚合（Multiphoton Polymerization, MPP）：
飞秒激光3D打印通常使用多光子聚合技术。这种方法可以在聚合物材料中产生高分辨率的3D微结构。通过精确控制激光的聚焦，可以在特定区域内引发光聚合反应，从而构建复杂的三维支架。
用于TPP的激光装置的原理图演示。[6]
[6]Zhang, W.; Han, L.-H.; Chen, S., Integrated Two-Photon Polymerization With Nanoimprinting for Direct Digital Nanomanufacturing. Journal of Manufacturing Science and Engineering 2010, 132 (3), 030907-030907-5. DOI: 10.1115/1.4001661.
2.激光直写技术（Laser Direct Writing, LDW）：
通过激光直写，飞秒激光可以被精确地引导至预定的材料路径，生成所需的微结构。这种技术允许在无需使用传统光刻技术的情况下，直接在材料上写入复杂的图案。
飞秒激光波导写入装置原理图。[7]
[7] Osellame, R.; Hoekstra, H. J. W. M.; Cerullo, G.; Pollnau, M., Femtosecond laser microstructuring: an enabling tool for optofluidic lab-on-chips. Laser & Photonics Reviews 2011, 5 (3), 442-463. DOI: 10.1002/lpor.201000031.
3.控制细胞行为和组织生长：
通过精确的3D打印技术，可以设计出促进细胞生长和组织形成的微环境。这些环境不仅支持细胞的附着和生长，还可以通过设计来指导细胞的空间排列和功能表达。
图12:用DLW三维制造聚合物复合材料支架的SEM图片。(a)含PEG
[8]Klein, F.; Richter, B.; Striebel, T.; Franz, C. M.; Freymann, G. v.; Wegener, M.; Bastmeyer,
M., Two-component polymer scaffolds for controlled three-dimensional cell culture. Advanced materials 2011, 23 (11), 1341-1345.
4.无掩模光刻：
飞秒激光3D打印技术不需要使用传统的掩模，从而提供了更高的设计灵活性和快速原型制作的能力。这对于定制医疗植入物和组织工程构建尤为重要。飞秒激光器因其独特的特性而在 3D 生物打印领域脱颖而出，这些特性完全符合打印可行的功能性器官的要求。
5.3D激光光刻(3DLL)
立体光刻是一种制造过程，通过该过程，光诱导光化学结构变化以打印图案和物体，允许从计算机绘制的设计中逐层生产任意 3D 对象。传统上，光敏聚合物通过紫外激光固化从液态转变为固态聚合物。将光引发剂激发到产生离子或自由基物质的状态，在中引发交联链式反应。激发和光聚合可以通过多光子吸收较低能量的光子来实现，这相当于通常由单一紫外光子吸收的能量。由于对激光强度的非线性依赖性和材料对单光子吸收的透明度，多光子吸收发生在超快激光的紧密焦点区域，这意味着可以完成更高的分辨率和内部修饰。多光子光刻技术（也称为3D激光光刻（3DLL）或多光子直接激光写入(MP-DLW））。在化学传感、微流控器件和微针方面有应用，但近年来微纳光学以及生物和组织工程受到广泛关注。
3D生物打印成功案例
双光子制备神经元生长3D微纳结构
通过飞秒直接激光写入制备不连续和各向异性微柱，形成具有不同间距和高度的图案化支架，发现这些支架会影响轴突和树突的分支和取向。有趣的是，轴突和树突倾向于在相同高度的 3D 微柱支架阵列上生长，并形成功能连接的神经元网络，如钙成像可视化的同步神经元活动所反映的那样。这种方法可能代表了一种很有前途的工具，用于研究3D环境中的神经元行为和定向神经元网络。
中国科学技术大学 李家文课题组基于飞秒激光双光子加工技术，探索了微纳结构对神经元生长行为的影响。他们利用飞秒双光子技术制备了不同间距和高度的图案化微柱阵列，发现神经元轴突倾向于在等高微柱上生长，通过构建微柱排布，能够引导神经元定向生长，并形成神经回路（Adv. Healthcare Mater. 2021, 10, 2100094）。受轴突髓鞘的启发，联合课题组通过设计制备了不同直径、壁厚和长度的微管结构，模拟轴突的髓鞘，发现微管结构能够加速神经突轴突的生长速度（10倍以上）。此外，联合课题组在微管表面磁控溅射了磁性薄膜镍和生物相容性薄膜钛，在外部磁场操控下，该磁性微管可用于神经元的精准连接，从而形成特定生物神经回路（Nano Lett., 2022, 22: 8991）。微纳结构能够实现神经元定向生长和加速生长，将为分离神经簇的定向连接、神经网络构建、神经损伤快速修复等提供方法和思路。
微纳结构对神经元轴突生长的影响：（a）神经元轴突沿着相同高度微柱定向生长；（b）多孔微管能够加速神经元轴突生长并可实现神经元的定向连接。[9]
[9]Accelerating Neurite Growth and Directing Neuronal Connections Constrained by 3D Porous Microtubes Shengying Fan, Lei Qi, Jiawen Li, Shunli Liu, Rui Li, Tongzhou Zhan, Xiaowei Li, Dong Wu, Pakming Lau, Bensheng Qiu, Guoqiang Bi, and Weiping Ding Nano Letters 2022 22 (22), 8991-8999 DOI: 10.1021/acs.nanolett.2c03232
全球医疗领域中的应用前景。
图1.组织工程和细胞生物学应用的光学微和纳米制造技术示意图。子弹点描述了这些技术在制造支架时所提供的优势。
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3D生物打印技术的技术限制
3D生物打印技术作为一种前沿的组织工程技术，虽然展现出巨大的潜力和前景，但在实际应用过程中仍面临许多技术限制：
生物墨水的制备与选择：生物墨水需要具备良好的生物相容性、合适的力学性能以及支持细胞生长的环境。此外，生物墨水的粘度、凝胶化时间和交联能力对打印的精确性和细胞的行为具有显著影响，不适当的墨水选择可能导致结构不稳定或细胞存活率低。
打印精度与分辨率：打印精度和分辨率直接影响到生成组织结构的功能性。尤其是在需要高度精细结构的应用中，如血管网络或复杂器官等，目前的技术还难以在三维空间中精确控制细胞的位置，这在多类型细胞和多层次结构的打印中尤为突出。
细胞存活率与功能维护：打印过程中涉及的物理力（如挤压）和化学因素（如光固化产生的热量）可能对细胞造成损伤。如何在打印过程中维持高细胞活性和功能是一个重要挑战。
多材料打印技术的整合：为了模拟复杂的生物组织，常需要使用多种生物墨水和支架材料。这些材料间的兼容性及其相互作用需要进一步研究和优化。同时，如何有效地整合不同的打印技术，如喷墨打印、挤出打印和激光辅助打印，以生产功能性更强的组织结构，也是技术上的一个挑战。
在组织工程和生物制造的背景下，高清生物打印可以定义为使用含有细胞的材料连续生产特征尺寸小于50 μm的3D结构的能力。在这个定义中，我们还包括材料不是逐行或逐层沉积的技术，但也包括那些在预沉积体积内进行3D扫描的技术。这包括部分体积的交联，但也包括其他光化学效应，通过在材料的骨干中创建或切割键而导致基质密度变化。
在现有的高清生物打印技术中，多光子光刻(MPL)显示了迄今为止最好的分辨率(<1 μm)，允许在透明细胞材料中进行交联或其他结构修改。最近，通过细胞电书写(EW)技术可以复制出比哺乳动物细胞更小的特征，这种技术可以沉积含有细胞的细细丝(5 μm)的水凝胶。
其他生物打印技术显示出进入高清领域的良好潜力，包括基于还原聚合的方法，如数字光处理(DLP)、立体光刻(SLA)和体积(生物)打印(VP)。这些技术正在迅速提高它们的分辨率，分别是通过减少印刷层厚度、像素尺寸或单线尺寸，以及通过开发先进的层析重建算法来提高对比度和更准确的光剂量分布。最后，允许操作和分配小体积(几pl)细胞负载材料的方法，如激光诱导正向转移和喷墨生物打印，正在寻找新的策略来打印形状良好且机械稳定的高纵横比结构，并在垂直方向上复制它们的高分辨率。
这项技术未来会产生什么影响？
飞秒激光技术在 3D 生物打印中的应用预示着医学治疗和器官移植的革命性转变。其最有前途的影响包括消除器官移植等候名单，实现高度定制和个性化的医疗治疗，减少手术风险和并发症，以及推动再生医学的进展。然而，这项突破性技术也伴随着伦理和社会问题，需谨慎管理。总体而言，飞秒激光技术将彻底改变器官移植方式，并挑战现有的医疗保健范式。